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21日龄断奶对仔猪肠道形态、肠道通透性及肠黏膜屏障的影响

放大字体  缩小字体 发布日期:2018-07-19  浏览次数:802
核心提示:导读我国传统的仔猪断奶时间为56日龄左右,而现代生猪养殖为了追求生产效率,仔猪早期断奶已成为规模化猪场的普遍生产方式,一般
导读

我国传统的仔猪断奶时间为56日龄左右,而现代生猪养殖为了追求生产效率,仔猪早期断奶已成为规模化猪场的普遍生产方式,一般在21~35日龄时断奶。然而,35日龄前仔猪消化道发育尚未健全,饲粮由液体母乳转为适口性较差的固体饲粮,使肠道内环境受到很大冲击。断奶伴随着转群运输、新猪舍环境适应、仔猪混养等,使仔猪发生断奶应激,引起采食量下降、消化不良、腹泻和生长缓慢等一系列“仔猪早期断奶综合征”。因此,选择合适的断奶时间,平衡母猪流转效率和仔猪健康,对于猪场的综合效益尤为重要。

肠道不仅是动物吸收营养的主要场所,也是体内重要的免疫器官。断奶应激严重损伤仔猪肠道形态和功能,导致肠黏膜屏障受损,引起肠道形态发生变化、肠道通透性增加,极大地影响其未来的生产性能和免疫功能。基于肠道功能发育规律是选择和优化仔猪断奶时间的关键基础。目前研究多集中在不同断奶日龄(14~35日龄)对仔猪生长性能、消化器官和酶活性的影响,但有关断奶后仔猪肠道形态和功能发育规律的研究较少。本试验旨在研究21~28日龄仔猪肠道结构、紧密连接蛋白和细胞因子的发育性变化以及21日龄断奶对仔猪肠道形态和功能的损伤,为合理选择早期断奶时间、制订预防断奶应激损伤策略提供新思路。

1材料与方法

1.1 试验设计与试验

饲粮采用2×3 双因子完全随机试验设计,组别(哺乳组、断奶组) 和日龄(22、24 和28 日龄) 为2 个主效应。选取6 窝体况相近的健康大白仔猪,每窝为10~12 头。21 日龄时,每窝选取6 头平均体重为(6.1±0.2) kg 的仔猪,随机分为2 组,分别为断奶组(于保育舍饲喂基础饲粮)和哺乳组(于原产床继续哺食母乳)。断奶仔猪单栏饲养,舍内温度和光照时间与哺乳仔猪保持一致,温度维持在30℃ 左右;自由饮水,采用湿拌料方式饲喂,每天08:00 和16:00 饲喂玉米-豆粕型基础饲粮。基础饲粮参照NRC(2012)营养标准配制成粉料,营养成分满足5~10 kg 仔猪的营养需要量,其组成及营养水平见表1。


1.2 样品采集

分别于22、24 和28 日龄时,仔猪禁食12 h后,进行前腔静脉采血,肝素抗凝,静置1 h,4 000 r/min离心后制备血浆,-80℃ 保存。按照窝源一致的原则,每窝选取2 头(哺乳组和断奶组各1 头,即每组6 头仔猪),放血处死后,剖开腹腔分离出空肠和回肠,采集空肠前端和回肠末端肠道,使用预冷的生理盐水轻轻冲洗后,手术刀刮取黏膜,分装于2 mL 冻存管,液氮速冻后转移至-80℃保存;剪取约1 cm 的空肠和回肠肠环,浸入4%多聚甲醛固定。

 

1.3 测定指标与方法

1.3.1 生长性能

分别于22 和28 日龄时对仔猪称重,计算仔猪断奶后的平均日增重(按照生长至28 日龄的12头仔猪计算)。每天观察仔猪的健康和腹泻情况,计算腹泻率。

腹泻率(%)=[试验期内仔猪腹泻头数/(试验天数×同组仔猪头数)]×100。

 

1.3.2 肠道形态

将固定好的空肠和回肠肠环组织石蜡包埋后切片(3~4 μm),采用苏木精-伊红(HE)染色,中性树脂封片,光学显微镜下观察。Leica LAX 软件拍照并对空肠、回肠的绒毛高度和隐窝深度作定量分析。

 

1.3.3 血浆和肠道黏膜的二胺氧化酶(DAO)活性

肠道黏膜组织进行10%组织匀浆。血浆和肠道黏膜组织液的DAO 活性采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定。


1.3.4 肠道黏膜相关基因表达

空肠和回肠黏膜总RNA 的提取采用试剂盒(QIAGEN),并用微量分光光度计(Bio-Drop) 测定总RNA 的纯度和浓度。按照试剂盒(PrimeScript™ RT Reagent Kit with gDNA Eraser,TaKaRa)操作步骤反转录合成cDNA。反应体系按照SYBR® Premix Ex Taq™试剂盒说明书配制。荧光定量PCR 反应条件:95℃ 预变性30 s;95℃ 变性10 s;60℃ 退火延伸30 s,共40 个循环;熔解曲线的制作参照荧光定量PCR 仪(Bio-Rad CFX 96)操作说明书进行。基因的mRNA 表达量采用2-ΔΔCt方法计算,以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参基因,引物见表2,由英潍捷基贸易有限公司合成。

 

1.4 数据统计

采用JMP 10.0 软件分析数据,生长性能采用t检验统计分析,其余指标采用2 ×3 双因子统计分析,Tukey 法进行多重比较。P<0.05 为差异显著, P<0.01 为差异极显著。

2结 果

2.1 21日龄断奶对仔猪生长性能的影响

由表3可知,2组仔猪的初重(断奶时体重)无显著差异(P>0.05)。与哺乳组相比,28日龄(断奶后第7天)时,断奶组仔猪的末重和平均日增重均极显著降低(P<0.01)。断奶组仔猪断奶后第1~3天的腹泻率高于哺乳组,但无显著差异(P>0.05)。

 

2.2 21日龄断奶对仔猪肠道组织形态的影响

由图1可知,断奶组仔猪的空肠绒毛脱落、隐窝凹陷。由表4可知,断奶组仔猪的空肠绒毛高度极显著低于哺乳组(P<0.01)。组别和日龄对空肠隐窝深度和绒毛高度/隐窝深度有极显著交互作用(P<0.01),断奶组的空肠隐窝深度极显著高于哺乳组(P<0.01),哺乳组的空肠隐窝深度随着日龄的增加逐渐降低,而断奶组则逐渐增加;22日龄时,断奶组的空肠隐窝深度与哺乳组相比无显著差异(P>0.05);24和28日龄时,断奶组的空肠隐窝深度极显著高于哺乳组(P<0.01)。断奶组的空肠绒毛高度/隐窝深度极显著低于哺乳组(P<0.01),哺乳组28日龄时的空肠绒毛高度/隐窝深度极显著高于22和24日龄时(P<0.01),而断奶组在不同日龄时无显著差异(P>0.05)。

 

由图2可知仔猪回肠形态的变化。由表5可知,与空肠不同,组别和日龄对仔猪的回肠绒毛高度有极显著交互作用(P<0.01),哺乳组的回肠绒毛高度极显著高于断奶组(P<0.01),哺乳组24日龄时的回肠绒毛高度极显著高于22日龄时(P<0.01),而断奶组在不同日龄时无显著差异(P>0.05)。断奶组的回肠隐窝深度极显著高于哺乳组(P<0.01),回肠隐窝深度随着日龄的增加逐渐增加(P<0.05)。断奶组的回肠绒毛高度/隐窝深度极显著低于哺乳组(P<0.01),2组的回肠绒毛高度/隐窝深度在不同日龄时均无显著差异(P>0.05)。

 

2.3 21日龄断奶对仔猪血浆和肠道黏膜DAO活性的影响

由表6可知,组别和日龄对仔猪的空肠黏膜DAO活性有显著交互作用(P<0.05),断奶组的空肠黏膜DAO活性极显著低于哺乳组(P<0.01)。2组的血浆DAO活性在不同日龄时无显著差异(P>0.05)。断奶组的回肠黏膜DAO活性显著低于哺乳组(P<0.05),但2组的回肠黏膜DAO活性在不同日龄时无显著差异(P>0.05)。

 

2.4 21日龄断奶对仔猪肠道黏膜紧密连接蛋白mRNA表达量的影响

由图3可知,组别和日龄对仔猪空肠黏膜闭锁蛋白(occludin)的mRNA表达量有极显著交互作用(P<0.01),哺乳组空肠黏膜occludin的mRNA表达量随着日龄的增加先升高后降低(P<0.05),断奶组在不同日龄时无显著差异(P>0.05);与哺乳组相比,断奶组22日龄时空肠黏膜occludin的mRNA表达量有下降趋势(P=0.05),24日龄时显著降低(P<0.05)。空肠黏膜闭锁小带蛋白1(ZO-1)的mRNA表达量随着日龄的增加先升高后降低(P<0.05)。断奶组回肠黏膜ZO-1和occludin的mRNA表达量显著低于哺乳组(P<0.05),24日龄时回肠黏膜ZO-1的mRNA表达量显著高于22日龄时(P<0.05)。

 

2.5 21日龄断奶对仔猪肠道黏膜细胞因子mRNA表达量的影响

由图4可知,组别和日龄对仔猪空肠黏膜肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA表达量有显著交互作用(P<0.05),断奶组24和28日龄时空肠黏膜TNF-α的mRNA表达量显著高于哺乳组(P<0.05)。断奶组空肠黏膜白细胞介素10(IL-10)的mRNA表达量显著低于哺乳组(P<0.05)。日龄对空肠黏膜细胞因子的mRNA表达量无显著影响(P>0.05)。

由图5可知,与空肠黏膜不同,组别和日龄对仔猪回肠黏膜细胞因子的mRNA表达量无显著交互作用(P>0.05)。回肠黏膜白细胞介素1β(IL-1β)的mRNA表达量随着日龄的增加而降低(P<0.05)。2组回肠黏膜细胞因子的mRNA表达量无显著差异(P>0.05)。

3讨 论

仔猪消化道发育尚未健全,肠道免疫功能低下,微生物区系不稳定,断奶时会遭遇环境、营养、心理等多方面的挑战,造成仔猪断奶后生理机能紊乱。研究表明,肠道疾病往往随着断奶应激而出现,这表明断奶应激在疾病感染中起到至关重要的作用。本试验中,21日龄断奶诱发了仔猪应激,表现为体重显著下降,平均日增重降低了86.46%,断奶后第1天有16.67%存在腹泻情况,生长性能受到严重影响。肠道是断奶应激的主要损伤部位之一。空肠和回肠是小肠中营养物质吸收的重要肠段,其绒毛形态和功能发育是否良好,直接影响机体对营养物质的吸收。本试验中,仔猪断奶后空肠和回肠绒毛变短,并伴有脱落现象,同时隐窝凹陷,说明21日龄断奶严重影响了仔猪肠道的形态和发育。断奶后绒毛变短,减少了肠道吸收面积,是引起仔猪平均日增重极显著降低的重要原因之一。

肠道绒毛作为机体营养物质吸收的主要部位,小肠绒毛上皮细胞将消化道中的氨基酸、葡萄糖、无机盐等吸收进入血液,若此部位受损,会影响营养物质的吸收。DAO主要存在于哺乳动物肠道黏膜或绒毛上皮细胞中,是组胺等多胺物质进行代谢的重要调节酶,并在细胞增殖中发挥重要作用,肠道黏膜DAO活性与肠道黏膜绒毛高度、肠上皮细胞的完整性和成熟度有密切关系。本试验结果表明,哺乳组仔猪的空肠黏膜DAO活性随着日龄的增加逐渐降低,断奶组却无显著变化,这表明哺乳期仔猪肠道处于不断发育的过程中,上皮细胞不断发生增殖分化,28日龄时空肠黏膜DAO活性降低说明仔猪肠道上皮细胞发育趋于稳定。而断奶组的仔猪回肠黏膜DAO活性显著低于哺乳组,说明21日龄断奶严重损坏仔猪肠道上皮细胞的完整性和成熟度,造成仔猪肠道绒毛变短。

肠道黏膜中肠上皮细胞、黏蛋白、肠道黏膜相关淋巴组织及其分泌的细胞因子、抗菌肽、微生物区系等形成了天然的屏障,维护肠道和机体健康。肠上皮细胞通过紧密连接等细胞连接形成机械屏障,外周血中DAO活性是肠上皮细胞机械屏障损伤的重要标志。正常生理条件下血浆DAO活性较低,当肠道黏膜受损时,DAO可以由肠黏膜进入血液循环导致血浆中DAO活性增加。本试验中,断奶后血浆DAO活性提高了10.67%,但由于动物个体差异大,未达到显著水平。断奶后回肠黏膜ZO-1、occludin的mRNA表达量显著降低,24日龄时空肠和回肠黏膜ZO-1的mRNA表达量显著高于22日龄时,这表明21日龄断奶,肠上皮细胞间紧密连接的结构蛋白表达在转录水平受到抑制,破坏了肠黏膜屏障,增加了肠道通透性。栾兆双研究发现,仔猪断奶后紧密连接蛋白ZO-1、occludin的mRNA表达量显著降低,28日龄后逐渐升高;Weiler等研究发现,在应激条件下,ZO-1、occludin的mRNA相对表达量降低,与本研究结果基本一致。28日龄时断奶仔猪空肠occludin的mRNA表达量基本达到哺乳仔猪水平,说明断奶7d后,肠道黏膜损伤基本得到修复。

得益于肠上皮细胞形成的机械屏障,水、离子等可溶性小分子物质可以选择性地通过,而毒素、病原体等有害物质被阻止进入。由于21日龄断奶造成了肠道屏障损伤,毒素、病原体等有害物质进入,可能激活肠黏膜中固有层淋巴组织、派伊氏结(PP结)、肠系膜淋巴结,产生免疫应答,分泌细胞因子。本试验研究发现,断奶组24和28日龄时空肠黏膜TNF-α的mRNA表达量显著高于哺乳组,而空肠黏膜IL-10的mRNA表达量显著低于哺乳组。Pié等研究也发现,仔猪断奶后肠道促炎性细胞因子IL-1β、白细胞介素6(IL-6)和TNF-α的mRNA表达量迅速升高,肠道出现炎症反应。研究表明,肠黏膜的树突状细胞在黏膜中不断捕获由杯状细胞转运的抗原,分泌IL-10和转化生长因子β(TGF-β)并迁移至肠系膜集合淋巴结,活化初始T细胞为Treg,在免疫耐受中发挥至关重要的作用。在人和小鼠中敲除抗炎性因子IL-10或其受体后会表现强烈的炎症反应,还使促炎性因子的分泌增加。与空肠黏膜相比,断奶并未引起回肠黏膜细胞因子mRNA表达量的显著变化,表明在断奶应激条件下仔猪回肠的免疫稳定能力优于空肠,推测与回肠上富有黏膜相关淋巴组织相关。PP结作为黏膜淋巴相关组织的重要组成部分,主要集中在回肠,它是一个完整的执行免疫应答的功能场所,聚集着执行适应性免疫的CD+4T细胞、CD+8T细胞、B细胞和巨噬细胞等,当肠道中的抗原被传递到黏膜相关淋巴组织后,会激活B细胞引起体液免疫应答,同时也可被树突状细胞捕获后活化T细胞,引起更强烈的免疫应答。本试验中回肠黏膜免疫屏障表现出的强耐受力可能与此机制相关。

断奶时间的选择不仅要考虑母猪的流转,还要考虑仔猪的成活率。目前猪场常采用21或28日龄断奶。21~28日龄是仔猪快速发育阶段,断奶的窗口期应基于仔猪发育的生理状况来确定。本研究结果表明,21~28日龄时,哺乳仔猪肠道绒毛持续发育,表现为绒毛高度逐渐增长;肠道屏障功能在24日龄时最高,表现为肠上皮细胞间的紧密连接蛋白的mRNA表达量最高,肠黏膜促炎性因子TNF-α的mRNA表达量在24日龄时下降。综合这些指标,24日龄是仔猪肠道发育的关键点。21日龄断奶后,仔猪生长至24日龄时肠道绒毛损伤最为严重,表现为肠道绒毛最短且脱落现象最严重、血浆DAO活性最高、肠道紧密连接蛋白的mRNA表达量严重下降、促炎性因子的mRNA表达量上升。由此可知,24日龄是断奶应激损伤最严重的时间点。在这个时间节点的严重应激损伤一方面是因为应激反应发展的进程,另一方面是因为仔猪肠道发育在24日龄前后的变化显著。尽管21日龄断奶后至28日龄,仔猪肠道形态、屏障功能均有所恢复,但推荐在24日龄时仔猪完成消化道发育进程后断奶。本研究还发现了断奶影响肠道屏障功能的重要黏膜细胞因子。关于饲料添加剂改善仔猪生长性能、维持肠道健康已有许多报道。因此,在选择合理的断奶时间的同时,配合新型饲料添加剂促进抗炎性细胞因子的表达、加强肠道屏障功能,将有助于仔猪更好地度过断奶应激。

4结 论

① 哺乳仔猪22~28 日龄肠道发育趋于成熟。

② 21 日龄断奶会破坏仔猪肠道上皮细胞的结构,肠道绒毛变短和脱落,影响营养物质吸收,造成仔猪腹泻,降低平均日增重。

③ 21 日龄断奶抑制肠道紧密连接蛋白mRNA的表达,损伤屏障功能,导致肠道通透性增加,引起肠道炎症反应。

④ 24 日龄是仔猪肠道发育的关键时间点,以24 日龄后断奶为宜。

注:本文由生物饲料开发国家工程研究中心(BFC)小编整理发布,如有任何建议或意见及投稿等,请您加小编微信(13260429991)交流互动。

 

参考文献略

责编:马维军;审阅:刘晶晶 博士

来源:动物营养学报;作者:夏冰 孟庆石 解竞静 吴维达 冯潇慧 唐湘方 张宏福

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